Die Aalmutter kommt gut an …

… zumindest bei den Teilnehmern der großen internationalen Forschungsprojekte BEAST und BALCOFISH, die mit der Aalmutter und anderen Fischarten den Zustand des Ökosystems Ostsee untersuchen. Die Projekte sind in diesem Jahr unter dem ERA-NET Programm BONUS angelaufen und das vTI beteiligt sich mit der Messung von PAH-Metaboliten und der Erfassung von Fischkrankheiten an der Datenerhebung.

Aber warum gerade die Aalmutter? Das Besondere an dieser verbreiteten Küstenfischart ist ihre Fortpflanzungsstrategie: Die Aalmutter ist lebendgebärend. Das heißt, dass man den Fisch mit den dazugehörigen Jungfischen bzw. Embryonen im Bauch gemeinsam fangen und untersuchen kann. Das interessiert besonders Reproduktionstoxikologen und man kann spekulieren, ob Schadstoffe in der Ostsee vielleicht die Entwicklung der Fischeier stören können. Diese Effekte könnten dann direkt mit den Daten des Muttertiers in Beziehung gesetzt werden.

Aber es gibt noch einen Grund, warum die Aalmutter unsere Aufmerksamkeit verdient: Sie hat grüne Gräten. Wie beim Hornhecht ist in das Skelet der Aalmutter das blau-grüne Mineral Vivianit, ein Eisen (III)Phosphat, eingelagert. Das Mineral ist völlig unbedenklich und das Fleisch der Aalmutter soll ganz lecker schmecken. Ich könnte mir ein schaurig schönes Fischgericht vorstellen, das sicherlich seine Liebhaber finden würde. Schade das Halloween gerade vorbei ist.

SETAC-GLB setzt sich für Forschungsförderung ein

Die deutschsprachige Ökotoxikologie-Szene traf sich vom 5.-7. Oktober  in Freising/Weihenstephan. Mit 250 Teilnehmern war die Tagung gut besucht. Die hohe studentische Beteiligung ist auch den von der SETAC-GLB ausgeschriebenen Nachwuchspreisen zu verdanken:  Die Preisträger 2009,  Dr. Urs Schenker und Jens Otte, hielten zwei souveräne Voträge.  Zahlreiche Beiträge, Diskussionsrunden und über 80 Poster waren für das Gelingen der Veranstaltung genauso wichtig wie der bayrische Abend im „Braustüberl“.

Trotzdem gab es auch kritische Töne: In einer Podiumsdiskussion unter der Leitung von Prof. Henner Hollert (im Bild ganz rechts) wurde die schlechte Fördersituation für Projektanträge mit ökotoxikologischer Fragestellung in Deutschland thematisiert. Die Ökotoxikologie ist zurzeit nicht „sexy“ genug, um gegen Modethemen wie Klimaforschung oder Biodiversität zu bestehen. Andere Länder wie England stehen in der Ökotoxikologie besser da, als Deutschland, wenn man die Zahl der Publikationen in diesem Themengebiet zugrunde legt. Ökotoxikologische Fragestellungen werden im Zusammenhang mit der Chemikalienbewertung (REACH) weiter wichtig bleiben. Deutschland sollte nicht durch zurückhaltende Förderpolitik auf gut ausgebildete Experten verzichten. Die SETAC-GLB wird sich für ein Umdenken in der Förderlandschaft  einsetzen.

Wie man Resorufin in Lösung bringt und die Reinheit prüft

Manchmal sind es die vermeintlich einfachen Dinge, die sich als unüberwindliche Hürden entpuppen. Eine Lösung mit definierter Menge Resorufin in Dimethylsulfoxid (DMSO) herzustellen, das kann doch nicht so schwer sein. Oder doch? Wenn man weiss wie es geht, dann ist es ganz einfach.

Resorufin ist der externe Standard für die EROD-Messung. Bei einem Standard ist es besonders wichtig, dass alles stimmt weil er ja die Bezugsgröße für alle Messwerte ist. Hier darf man ruhig ein bisschen mehr Mühe investieren. Der Trick beim Lösen ist, dass man das Resorufin  in DMSO rühren muss und zwar wirklich zwei Tage und zwei Nächte lang. Nach 24 Stunden sieht es aus, als würde sich das Resorufin nie lösen, aber mit Geduld funktioniert es. Und bitte keine restlichen Krümel abfiltrieren sondern weiter rühren. Am Ende hat man zum Beispiel  eine Stammlösung mit der Konzentration 1 mg/ml in DMSO.

Der zweite wichtige Punkt ist die Prüfung der Reinheit. Immer wieder liest man von Problemen mit unreinem Resorufin. Die Reinheit kann man photometrisch über den molaren Extinktionskoeffizienten von Resorufin prüfen. Das ist eine wahre „old school-Methode“, die heute kaum noch jemand kennt. Die Messung erfolgt in wässrigem Phosphatpuffer bei pH 8. Also muss unsere DMSO-Stammlösung intensiv verdünnt werden, damit das DMSO die Photometrie nicht stört.

Danach kann man aus der Stammlösung eine Arbeitslösung mit der gewünschten Konzentration durch Verdünnen mit DMSO herstellen. In meinem Beispiel hat  die Arbeitslösung eine Konzentration von 0,002 mg/ml bzw. 0,0085 µmol/ml Resorufin. Diese Lösung aliquotiere ich und lagere sie im Tiefkühlschrank. Für jede Messung wird ein Vial aufgetaut und die Reste verworfen. Das geht wunderbar.

Alle Schritte mit Rechenbeispiel sind nachzulesen auf den unten verlinkten pdf.

Gift aus PET-Flaschen

Vor kurzem erschien in der Zeitschrift „Environmental Science and Pollution Research“ ein wissenschaftlicher Artikel von M. Wagner und M. Oehlmann über hormonell aktive Substanzen, die aus PET-Flaschen in Mineralwasser übergehen. Die Wissenschaftler haben in Wasserflaschen aus dem Supermarkt östrogene Wirksamkeit mithilfe einer speziellen Zellinie festgestellt. Die in PET-Flaschen gezüchtete Schnecken hatten mehr Nachkommen, als solche die in Glasflaschen aufgezogen wurden. Beide Testsysteme zeigen deutlich, dass östrogen wirksame Stoffe in Mineralwasser übergehen können.

Diese neue Erkenntnis ist erstaunlich, da man bei Östrogenen aus Nahrungsmitteln bisher nicht an Wasser gedacht hat. Die absolute Menge an östrogener Wirksamkeit aus PET-Flaschen ist zwar nicht  sehr hoch, aber sie ist messbar, trägt zur Gesamtbelastung bei und sie kommt aus einer unerwarteten Quelle.  Wer weiß, vielleicht erleben wir noch mehr Überraschungen aus dieser Richtung?!

Diese Ergebnisse werden kontrovers diskutiert. Das BfR (Bundesinstitut für Risikobewertung) sieht  »für die Verbraucher keine Notwendigkeit, auf Mineralwasser aus PET-Flaschen zu verzichten«, da es erstens noch offene Fragen in der zitierten Untersuchung gibt und wir zweitens über sehr geringe Konzentrationen von östrogenen reden. In Milch ist zum Beispiel mehr drin.

Kennen Sie PAKs?

Warum soll man die Wurst auf dem Grill nicht verbrennen lassen? Warum ist zu viel Räucherfisch ungesund und woher kommt die Raucherlunge? Was belastet die Natur bei Öltankerunfällen? Was macht Probleme in alten Parkettklebern?
Bei allen diesen Fragen spielen PAKs (polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe) eine Rolle. PAKs sind keine Erfindung der chemischen Industrie sondern sie sind schon seit es Kohle, Erdöl oder Verbrennungsprozesse unter Sauerstoffabschluss gibt  in der Umwelt zu finden. Außerdem sind diese Substanzen sehr langlebig (persistent). Folglich sind die Meeressedimente und die Flussbetten Europas voll davon. Im Wasser lösen sich diese Substanzen nicht so gut – PAKs lieben das Fett.

Und so warten die PAKs im Sediment geduldig bis eine Wurm oder ein Seestern greifbar ist, damit sie dort im fettähnlichen Gewebe akkumuliert oder verstoffwechselt werden können. Man könnte vermuten, dass sich in der höchsten Gliedern der Nahrungskette auch die höchsten PAK-Gehalte finden – aber das ist nicht so denn PAKs werden im Organismus abgebaut. Niedere Tiere wie Würmer haben noch nicht das notwendige Enzymsystem, aber der Fisch, der den Wurm frisst, baut die PAKs ab. „So what ?“ Fragt man sich. Dann ist das Problem doch aus der Welt? Oder doch nicht?!

Leider nicht, denn bei der Metabolisierung entfalten PAKs ihre Giftigkeit: Sie werden zu gefährlichen Epoxiden oxidiert, die mit der DNA reagieren können. Das führt im ungünstigen Fall zu einem Tumor. Daher ist es wichtig die Belastung mit PAK zu untersuchen. In Meeresfischen verwendet man dazu den Gehalt an PAK-Metaboliten in der Galle. Dort sammeln sich einige der vom Fisch verstoffwechselten Substanzen und können leicht analysiert werden. In der Abbildung sind die Gehalte von der Leitsubstanz unter den  PAK-Metaboliten (1-Hydroxypyren in ng/AE380nm) in den Fischarten Kliesche, Flunder und Kabeljau von 1994 bis 2007 zusammengefasst. Rote Gebiete kennzeichnen hohe, gelbe Gebite niedrige Konzentrationen.  Man erkennt Unterschiede in der Belastung zwischen Deutscher Bucht, Nord- und Ostsee. Dieses Bild ist das Produkt von über 2000 gemessenen Fischproben, die auf der hohen See gefangen wurden. Aus diesen Daten kann abgeleitet werden, in wie starkem Maß die Fische giftigen PAKs ausgesetzt sind. Weitere Messungen in der östlichen Ostsee in Kombination mit der Erhebung von Fischkrankheiten sind in Planung.

Das Thema PAK in Meeresfischen und Seehunden wird auf meinem englischen Poster für die SETAC 2009 in Göteburg behandelt. Eine pdf-Version kann durch Klicken auf das kleine Bild heruntergeladen werden.

Küvetten – ein Kessel Buntes

Küvetten gibt es in vielen Spielarten und über die Jahre sammelt sich so einiges in den Schubladen an. Welche Küvette ist jetzt die richtige für meine Messung? Ein wichtiges Kriterium zur Unterscheidung ist das Material der Küvette. Im sichtbaren Bereich (farbige Lösungen) kann man kaum etwas verkehrt machen, aber wer im UV-Bereich messen will braucht eine UV-durchlässiges Material, damit das Licht nicht von der Küvette ausgebremst wird. Das Material ist bei klassischen Küvetten, wie denen auf dem Foto, meist über einen Code direkt an der Küvette angegeben. Man findet die folgenden Kürzel:
G: optisches Glas: 334-2500 nm
SOG: optisches Spezialglas 320-2500 nm
PX: Pyrex 325-2500 nm
Q: Quarzglas für fernes UV 170-2700 nm
I: Quarzglas für nahes Infrarot 220-3800 nm
SX: fernes UV-IR, Quarz wasserfrei 170-3500 nm

Die kleinere Zahl des Wellenlängenbereichs wird als „cut off Wellenlänge“ bezeichnet, weil drunter nichts mehr geht und das Spektrum im Scan wie abgeschnitten wirkt.

Einwegküvetten aus Kunststoff (Polystyrol oder Polymethylacrylat) sind in der Regel nicht für UV-Messungen geeignet und funktionieren erst oberhalb von 340 bzw. 300 nm. UV-Küvetten aus Kunststoff sind etwas teurer und können für UV-Messungen ab ca. 200 nm verwendet werden. Optisch kann man diese Küvetten nicht voneinander unterscheiden. Also immer auf den Karton gucken. Wer ein Zweistrahlphotometer besitzt und eine Referenzküvette gleichzeitig mit der Probe misst, sollte darauf achten, dass er Küvetten aus der gleichen Kiste bzw. Pärchen verwendet, die aufeinander eingeschliffen sind.

Eine zweite wichtige Überlegung ist der Strahlengang. Bei der üblichen UV/Vis-Photometrie geht der Lichtstrahl einmal durch den Küvettenquerschnitt; meist mit einem Lichtweg von 10 mm. Daher haben Küvetten für UV/Vis zwei gegenüberliegende polierte, glatte und zwei blinde Seiten. Wie herum man die Küvette in den Halter platzieren muss, sollte klar sein. Will man Fluoreszenz messen, muss man wissen, dass bei dieser Messung der Strahlengang rechtwinklig verläuft. Man braucht also eine Küvette mit zwei polierten Seiten im rechten Winkel zueinander bzw. eine Küvette mit vier polierten Seiten, wie bei Fluoreszenzküvetten üblich.

Der Dritte Punkt dreht sich um das Volumen der Küvette. Man unterscheidet Makro (ca. 2 ml, im Bild 1.u.2.vl), Halbmikro (ca. 1,5 ml, im Bild 3.u.4.vl) und Mikro (ab ca. 500 µl, im Bild 2.u.3.vr). Bei allen Küvetten ist der Strahlengang gleich lang, also 10 mm. Nur gefüllt werden die Küvetten mit unterschiedlichen Volumina. Wie viel Lösung minimal in der Küvette sein muss, hängt von der Lage des Lichtstrahls ab. Mit etwas Geschick kann man mit 500 µl eine Halbmikroküvette ausreichend hoch füllen. Bei der Ultra-Mikroküvette im Bild ganz rechts reichen schon 70 µl für eine Füllung. Allerdings ist die Probe kaum rückgewinnbar und man muss hinterher die kleine Küvette reinigen und trocknen bzw. mit der Lösung spülen. Der Lichtstrahl muss das kleine Fenster im schwarzen Sockel treffen, sonst geht es nicht. Hier ist die Gefahr groß, dass mit einen schlecht fokussierten Strahl Intensität bzw. Empfindlichkeit verloren geht. Man sollte sich immer über den Verlauf des Lichtstrahls informieren, bevor man misst.

Der Star unter den Ultra-Mikroküvetten ist die faseroptische Messzelle. Das Bild rechts zeigt den Kopf einer solchen Messzelle, auf den man nur 5µl Probe pipettieren muss. Mit dem innen verspiegelten Deckel versehen erreicht die Messlösung eine Schichtdicke von 1 mm (es gibt auch andere Deckel). Das entspricht einer virtuellen Verdünnung von 1:10 gegenüber 10 mm Standard-Küvette. Das Licht wird durch Lichtleiter so umgeleitet, dass man die Küvette wie gewohnt in den Strahlengang des UV-Photometers stellen kann. Wer geizig mit seiner Messlösung sein muss ist hier richtig. Eine ideale Lösung für DNA/RNA Reinheitsbestimmungen und den gut gefüllten Geldbeutel.

Der Fluch der Poster Handouts

Auf einer großen Konferenz wie der SETAC 2009 in Göteburg will jeder der über 1500 Konferenzbesucher ein Poster zeigen, einen Vortrag halten oder eine Session leiten. Die „alten Hasen“ bieten gleich einen ganzen Blumenstrauß dieser Aktivitäten an und erscheinen im Abstract-Book mit eine langen Aufzählung solcher Aktivitäten. Je länger die Liste, desto wichtiger die Persönlichkeit bzw. desto größer seine/ihre Arbeitsgruppe und Netzwerk.

Vier Tage  lang wurden auf der Konferenz morgens gefühlte 500 Poster aufgehängt und abends wieder abgenommen um Platz für die Poster des folgenden Tages zu schaffen. Das ist eine Informationsflut in Tsunami-Größe.

Und was sind jetzt Poster-Handouts? Das ist die papiergewordene Take-Home-Message: Eine Din-A4-Version des Posters, die man einsammeln und später lesen kann. Bei hunderten von Postern täglich ist es kaum möglich auch nur die wichtigsten direkt zu erfassen. Und was ist mit den anderen? Nun von denen nimmt man sich eben ein Handout mit.

Diese Handouts sind aber irgendwann mal alle. Der findige Handoutsammler lässt also am frühen Vormittag gezielt eine Session aus, um VOR der offiziellen Posterbegutachtung in der ersten Kaffeepause  schnell alle wichtigen Handouts einzusammeln. Nach vier posterhaltigen Tagen hat er dann einen dicken Stapel an Informationen zum nach hause tragen. Leider macht das viel Stress während der Konferenz und  die Erfahrung zeigt, dass man diese Handouts nicht liest sondern sie nach einigen Jahren im Schreibtisch wieder findet und nur noch wegwirft.

Also was tun? Mit den Leuten vor den Postern sprechen und diskutieren halte ich für viel wertvoller. Lasst die Handouts stecken, tauscht Visitenkarten und redet auch mal mit einem Posterpresenter vor einem vermeintlich uninteressanten Poster. So macht Konferenz auch am letzten Tag noch Spaß!

RNA-Isolierung aus Zebrafisch Embryonen oder Larven

Die Isolierung von RNA ist nicht trivial – schon gar nicht aus Fischeiern. Wenn man einige Randbedingungen beachtet ist es aber einfacher als man denkt. Der größte Feind der RNA sind RNAsen, die praktisch überall - besonders an den Fingern des Analysators – zu finden sind. Also: Embryonen in flüssigen Stickstoff schockgefrieren, schnell und in RNAse-Inhibitor Puffer wieder auftauen. Handschuhe, Kittel und ein sauberer Arbeitsplatz sind Pflicht. Bitte auch die Plastikteile nur mit sauberen Handschuhen oder Pinzetten anfassen. Pipettenspitzen mit Handschuhen in die Boxen stecken oder fertig gesteckte verwenden. Frisch gekaufte Plastikwaren sind in der Regel RNAse frei. Die Probe sollte während der Extraktion immer auf Eis gekühlt werden, obwohl RNA höhere Temperaturen verträgt. Potentiell enthaltene Enzyme kommen in der Kälte aber nicht zum Zug.

1. Vor der RNA-Extraktion muss homogenisiert werden. Für Gewebe wie Embryonen oder Larven eignet sich ein Pistell im (blauen) Reaktionsgefäß. Diese Pistelle sind Einwegartikel, die man im Laborfachhandel kauft. Motorgetriebene Varianten sind auch schön.
   Alle nötigen Puffer sind im Extraktions-Kit der Säulen enthalten und gewährleisten stark denaturierende Bedingungen  mit Guanidinium Isothiocyanat und ß-Mercaptoethanol.
2. Nach dem Mörsern wird die Probe mehrfach mit einer 1 ml Einweg-Spritze aufgezogen. Auch das dient der Homogenisierung.
3. Extrahieren kann man das Homogenat auf verschiedene Weise. Am einfachsten und am teuersten ist die Verwendung von Extraktionskits mit Säulen für die Zentrifuge (spin-columns). Hier werden die selektiven Bindungseigenschaften einer Silica-Membran mit Zentrifugations- und Waschschritten kombiniert. Die RNA (> 200 Nukleotidetide) wird in Gegenwart eines Puffersystems mit einer hohen Konzentrationen an chaotropen Salzen an die Silica-Gel Membran gebunden und nach mehreren Waschschritten mit ca. 30 μl nukleasefreiem  Wasser eluiert.
   Die abgebildete Variante eignet sich gut für 10 – 100 Eier / Larven.
4. Aus 10 Larven kann man so etwa 5 µg RNA in nur wenigen Arbeitsstunden extrahieren. Diese Menge ist für die meisten PCR-Anwendungen ausreichend auch wenn der Anteil mRNA (messenger RNA) nur 2% der isolierten Gesamt RNA ausmacht.

Ethidiumbromid im Biochemie-Labor

Die jahrelange Verwendung von rotem, giftigen Ethidiumbromid kann man ganz einfach dadurch sichtbar machen, dass man die Fluoreszenz-Lampe in der Deckenbeleuchtung zuschaltet. Das Resultat sähe dann so ähnlich aus wie auf diesem Foto.

Das Bild stammt natürlich NICHT aus einem Labor sondern gehört in eine Hamburger Kunstausstellung.
Trotzdem könnte die Wirklichkeit nicht weit von der Situation im Bild entfernt sein. Natürlich haben wir alle keine Kaffeemaschine im Labor stehen

Der Hirsch-Index

Der Hirsch-Index, oder h-index, ist ist ein Maß dafür, wie interessant die Artikel sind, die ein/e Wissenschafler/in veröffentlicht. Das heisst: Wie oft die Artikel von anderen gelesen und zitiert werden. Wenn ich, wie in dem Beispiel in der Grafik, einen Hirsch-Index von 10 habe, dann habe ich 10 Publikationen, die 10 mal oder mehr zitiert worden sind. Das ist schon gar nicht so schlecht. Ich bin mit diesem Hirsch-Index zwar noch nicht in der Top 100 Liste der lebenden Chemiker , aber ich arbeite daran.
Eine einzelne Nature-Publikation mit einem astronomischen Impact-Faktor der Zeitschrift und 100 Zitaten verändert meinen Hirsch-Index nicht so stark wie es für anderen bibliometrische Kennzahlen der Fall wäre.

Vorgeschlagen hat diesen Index ein Herr J.E. Hirsch in den „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America“ am 15. November 2005. Man kann ihn auf der ISI Web of Knowledge Seite aus dem „Citation Report“ der eigenen Publikationen (oder denen des Chefs) berechnen lassen.