RNA-Isolierung aus Zebrafisch Embryonen oder Larven

Die Isolierung von RNA ist nicht trivial – schon gar nicht aus Fischeiern. Wenn man einige Randbedingungen beachtet ist es aber einfacher als man denkt. Der größte Feind der RNA sind RNAsen, die praktisch überall - besonders an den Fingern des Analysators – zu finden sind. Also: Embryonen in flüssigen Stickstoff schockgefrieren, schnell und in RNAse-Inhibitor Puffer wieder auftauen. Handschuhe, Kittel und ein sauberer Arbeitsplatz sind Pflicht. Bitte auch die Plastikteile nur mit sauberen Handschuhen oder Pinzetten anfassen. Pipettenspitzen mit Handschuhen in die Boxen stecken oder fertig gesteckte verwenden. Frisch gekaufte Plastikwaren sind in der Regel RNAse frei. Die Probe sollte während der Extraktion immer auf Eis gekühlt werden, obwohl RNA höhere Temperaturen verträgt. Potentiell enthaltene Enzyme kommen in der Kälte aber nicht zum Zug.

1. Vor der RNA-Extraktion muss homogenisiert werden. Für Gewebe wie Embryonen oder Larven eignet sich ein Pistell im (blauen) Reaktionsgefäß. Diese Pistelle sind Einwegartikel, die man im Laborfachhandel kauft. Motorgetriebene Varianten sind auch schön.
   Alle nötigen Puffer sind im Extraktions-Kit der Säulen enthalten und gewährleisten stark denaturierende Bedingungen  mit Guanidinium Isothiocyanat und ß-Mercaptoethanol.
2. Nach dem Mörsern wird die Probe mehrfach mit einer 1 ml Einweg-Spritze aufgezogen. Auch das dient der Homogenisierung.
3. Extrahieren kann man das Homogenat auf verschiedene Weise. Am einfachsten und am teuersten ist die Verwendung von Extraktionskits mit Säulen für die Zentrifuge (spin-columns). Hier werden die selektiven Bindungseigenschaften einer Silica-Membran mit Zentrifugations- und Waschschritten kombiniert. Die RNA (> 200 Nukleotidetide) wird in Gegenwart eines Puffersystems mit einer hohen Konzentrationen an chaotropen Salzen an die Silica-Gel Membran gebunden und nach mehreren Waschschritten mit ca. 30 μl nukleasefreiem  Wasser eluiert.
   Die abgebildete Variante eignet sich gut für 10 – 100 Eier / Larven.
4. Aus 10 Larven kann man so etwa 5 µg RNA in nur wenigen Arbeitsstunden extrahieren. Diese Menge ist für die meisten PCR-Anwendungen ausreichend auch wenn der Anteil mRNA (messenger RNA) nur 2% der isolierten Gesamt RNA ausmacht.