Das ist eine typische Frage aus dem Bereich der Chromatographie. Der externe Standard ist ein robuster VW-Käfer, der für die meisten Anwendungen ausreicht. Der interne Standard ist schon ein schicker Sportwagen wie ein Opel GT mit dem man schnell und elegant zum Ziel kommt. Wer Isotopenstandards verwendet fährt quasi einen Formel 1 Rennwagen. Aber zum Brötchenholen reicht der Käfer allemal.
Ein externer Standard ist eine Lösung mit definierter Konzentration meines Analyten. Ich messe dasselbe Volumen meiner Probenlösung und meiner Standardlösung, bekomme zwei Werte und rechne den Wert aus der Probenlösung über den Dreisatz in Konzentration um. Schön einfach und unkomliziert.
Ein interner Standard ist eine Substanz die nicht mein Analyt ist und die ich meiner Probenlösung spätestens vor der Messung zugesetzt habe. Typischerweise wird der interne Standard vor der Aufarbeitung der Probe zugegeben und kann so auch noch Verluste bei der Probenvorbereitung abpuffern. Beide Substanzen dürfen sich im Messverfahren nicht überlagern und müssen in derselben Messung bestimmbar sein – am besten mit ähnlicher Empfindlichkeit. Zum Beispiel zwei Peaks von chemisch verwandten Substanzen in einem Chromatogramm. Als zweite Lösung habe ich eine Standardlösung die meinen Analyten und den internen Standard in bekannten Konzentrationen enthält. Den passenden internen Standard mus man erst mal haben und die Rechnerei ist auch komplizierter als bei einem externen Standard.
Beim Internen Standard sind die absoluten Peakflächen wurscht. Es wird nur mit Verhältnissen gerechnet. Das ist immer dann von Vorteil, wenn das Volumen der Probe vor der Injektion klein oder ungenau zu messen ist. Oft ist das bei der Rückstandsanalytik mit Gaschromatographie der Fall: Die Injektionslösung wird unterm Sticksoffstrom auf z.B. 0,2ml eingedampft. Das Volumen ist dann ist kaum genau zu messen und das flüchtige Lösungsmittel tut ein Übriges. In so einer Situation MUSS man interne Standards nehmen. Wer bequem aus einem 5 ml Volumen injizieren kann, das vielleicht in einem Messkolben aufgefüllt wurde, der braucht keinen Sportwagen sondern kann mit dem Käfer weiterzuckeln. Die Messwerte wüden durch interne Standards nicht (viel) besser werden.
Ein interner Standard MUSS auch verwendet werden, wenn man mit signifikanten Verlusten bei der Probenaufbereitung rechnet, oder während der Aufarbeitung nicht quantitativ arbeiten kann. Hier ist es zusätzlich wichtig, dass der interne Standard die gleiche Chance hat bei der Probenaufarbeitung zu verschwinden wie der Analyt, weil er sich chemisch und physikalisch ähnlich verhält. Wenn beide Substanzen in der Aufarbeitung zu 80% verlustig gehen und dieses Verhältnis konstant bleibt, ist alles gut und man kann messen.
Praktisches Vorgehen für Messung mit internen Standards und Kalibrierfunktion:
- Standardlösungen mit dem Analyten in verschiedenen Konzentrationen in Messkolben ansetzen
- Internen Standard zu allen Standardlösungen in der selben Konzentration zugeben – erst jetzt Kolben auffüllen.
- Standardlösungen messen und Kalibration erstellen (Verhältnis der Peaks gegen Verhältnis der Konzentration von internem Standard und Analyt)
- Internen Standard zur Probe geben
- Probe messen und Konzentration des Analyten über Peakverhältnis aus der Kalibration berechnen.
Üblich ist HPLC mit externen Standard und GC mit internen Standards zu betreiben, da das Problem der kleinen Volumina beim GC regelmäßig auftritt.
Interne Isotopenstandards werden erst beim GC-MS sinnvoll, aber selbst hier reichen ab und zu die normalen internen Standards aus.
