Proteinbestimmung nach Lowry

Noch so ein angestaubter Klassiker aus der Biochemiewelt: Lowry. Es hilft, wenn man das Prinzip verstanden hat bevor man mit der Messung beginnt, denn bei dieser Methode zur Proteinbestimmung werden die aromatischen Aminosäuren und Cystein in der Probe bestimmt. Das Ergebnis ist daher abhängig von der Aminosäurezusammensetzung des Standards und der Probe.

Sechswertiges Molybdän (eingesetzt als Heteropolyphosphorsäure) wird durch die Tyrosin-, Tryptophan, Cystein- und Histidinreste in Proteinen zu einem kolloidal gelösten Mischoxid (MoO₂+MoO₃) von blauer Farbe reduziert (Molybdänblau-Reaktion). Cu²⁺-Ionen verstärken die Empfindlichkeit des Nachweises. Das Folin-Reagenz enthält unter anderem Natriumwolframat (Na₂Wo₄) und Natriummolybdat (Na₂Mo₄).

Die Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951) wird durch Tris, Ammoniumsulfat, EDTA, Saccharose, Citrat, CAPS, CsCl, Cystein, Diethanolamin, Dithiothreitol, HEPES, Mercaptoethanol, Polivinylpyrolidon, Natriumsalicylat, Thimerosol. Tricine, Triton X-100 und Phenole gestört. (Aha! Das sind ein paar Kandidaten mit Thiol-Gruppen und aromatischen Strukturen dabei. Als hätten wir’s geahnt, dass die stören würden ;-) Liegen solche Substanzen in der Probe vor, müssen die Proteine mit Trichloressigsäure ausgefällt und anschließend in einem wässrigen Lösungsmittel, das diese störenden Substanzen nicht enthält, gelöst werden.

Leider ist bei Lowry die Extinktion von der Aminosäurezusammensetzung des Proteins abhängig – also dem Anteil der jeweils nachgewiesenen Aminosäurereste am Gesamtprotein. Einzelne Aminosäuren werden genauso angezeigt wie proteingebundene; Hauptsache sie sind aromatisch oder haben eine SH-Gruppe. Dieses Problem muss auch bei der Auswahl eines geeigneten Standards berücksichtigt werden. In der Regel wird Rinderserumalbumin als Standard verwendet, aber die Aminosäurenzusammensätzung in der Probe kann davon deutlich abweichen. Das mit Lowry auch freie Aminosäuren gefunden werden muss kein Nachteil sein, führt aber u.U. zu abweichenden Resultaten  im Vergleich zu Methoden die auf dasProtein selbst reagieren, so wie Bradford.

Außerden sollte man wissen, dass man bei Lowry mit einer Stoppuhr arbeiten muss, um die genauen Zeitabstände einzuhalten. Das kann bei mehr als 10 Proben schon zu einer Herausforderung werden. Außerdem bleibt die Farbe nur eine Stunde lang stabil. Versierte Kräfte schaffen ca. 20 Proben und 5-8 Standards in einem Durchgang.

Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. and Randall R.J. 1951. Protein measurement with a Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275.

Diese Literaturstelle ist die meistzitierte  Arbeit aller Zeiten. Da haben die Autoren gute Arbeit geleistet und freuen sich vermutlich über einen astronomischen Hirsch-Index.

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