Grün ist die Galle

Hat ein Fisch gefressen, wird die Gallenflüssigkeit zur Verdauung gebraucht und die Gallenblase ist danach leer. Hat der Fisch seine Mahlzeit verdaut und füllt sich seine Gallenblase langsam wieder, so ist die Farbe der Flüssigkeit erst hellgrün und wird nach und nach dunkler. Fastende Fische haben eine  dunkelgrüne Galle, die im Extremfall fast schwarz werden kann.
Die Gallenfarbe kann man im Photometer über die Absorption bei 380nm (gemischte Gallenpigmente) oder bei 660 nm (Biliverdin) recht einfach messen. Mit dieser Messung erhält man über die Gallenfarbe eine Information, die man auch bei Untersuchungen zur Magenfüllung der Fische erwarten würde.
Bei Aalen geht die Umwandlung vom Gelbaal zum abwanderbereiten Blankaal mit dem Ende der Fressaktivität einher. Die dunkle Galle eines nicht fressenden Aals ist also ein indirekter Hinweis auf die Umstellung des Stoffwechsels und die einsetzende Gonadenentwicklung. In der unten zitierten Publikation ist die Konzentration der Galle (gemessen über Gallenfarbe und PAH-Metaboliten in der Galle) von Aalen  mit dem bekannten “Silvering Index”,  als Maß für den Reifezustand, verglichen worden.

• The silvering process of European eel (Anguilla anguilla) influences PAH metabolite concentrations in bile fluid: consequences for monitoring. Chemosphere. 2012, 87(1):91-6.

Es zeigte sich, dass die einfache und schnelle Messung der Gallenfarbe sehr eng mit dem Silvering Index verbunden ist, und daher Informationen über Ernährungszustand des Fisches bzw. Reifezustand beim Aal zulässt. In der Publikation geht es eigentlich um PAH-Metabolite und ihrem Potential zur Beschreibung geeigneter Habitate für den Aal-Besatz in Deutschland. Die Geschichte mit der Gallenfarbe war eher ein Randaspekt, aber für den Aal kann man mit dieser Messung wichtige physiologische Informationen gewinnen.

Ölförderung in der Nordsee beeinflusst die Fische

In einem kürzlich erschienenen Artikel von norwegischen Kollegen wird beschrieben, dass Fische, die in der Nähe von Ölplattformen in der Nordsee gefangen wurden, nicht nur nachweislich höher mit Ölinhaltstoffen (PAH) belastet waren, sondern auch veränderte Enzymaktivitäten, eine abweichende Fettzusammensetzung und mehr DNA-Addukte in der Leber zeigten, als Fische aus Vergleichsgebieten. Auch abseits der Küsten gibt es also mehr Schadstoffeffekte, als nur ein Grundrauschen.

Kurzfassung in englisch 
Gesamter Artikel

Dioxin im Weseraal

Die Zeitung “Dewezet” berichtet in ihrer Ausgabe vom 9.6.2011 von der Dioxinbelastung im Weseraal. Als hätten wir es geahnt: Dioxine und ähnlich wirkende Verbindungen sind reichlich vorhanden und vom Verzehr der Aale aus der Weser wird abgeraten. Über Grenzwerte kann man lange diskutieren und kein Dioxin über die Nahrung aufzunehmen ist schwierig – dennoch gehören Aale zu den Fischen, die vergleichsweise viel Dioxin enthalten.

2011-06-09_DEWEZET

Fettbestimmung nach Smedes

Foppe Smedes hat die Analytik von Gesamtfettgehalt in Fischen mit seiner 1999 publizierten Methode deutlich verbessert: Seine Methode verzichtet auf halogenierte Lösungsmittel und extrahiert trotzdem so gut, wie die Methode von Bligh und Dyer von 1959, auf der sie basiert. Foppe Smedes ist der Namenspatron der “Fettbestimmung nach Smedes” geworden und seine Publikation wird entsprechend häufig zitiert.
Congratulations, Foppe – well done!
Die einfachen Dinge sind oft die besten, weil sie zuverlässig funktionieren und belastbare Ergebnisse liefern. Die von Foppe Smedes verwendeten Lösungsmittel sind so gewählt, dass sie der Polarität der halogenierten Originale bei Bligh und Dyer entsprechen.

Kurz gesagt werden etwa 5 g feuchtes Probenhomogenat genau in ein Zentrifugenröhrchen eingewogen, dort mit  Isopropanol/Cyclohexan vom Ultraturrax gemischt bzw. extrahiert und anschließend zentrifugiert. Die organische Phase wird in einen gewogenen Rundkolben überführt. Nach einer zweiten Extraktion und Zentrifugation mit dem Lösungsmittelgemisch werden die vereinigten organischen Extrakte am Rotationsverdampfer abgezogen und der Rundkolben mit dem verbliebenen Fett im Trockenschrank getrocknet, im Exsikkator abgekühlt und auf 0,1 g genau ausgewogen. Der Fettgehalt wird am Ende per Dreisatz errechnet und in Prozent angegeben.
Brillant einfach, oder?

Proteinbestimmung nach Bradford

Der Methode nach Bradford gehört zu den Klassikern der biochemischen Analytik. Wer schon mal Protein bestimmt hat und ein Plattenphotometer sein Eigen nennt, der kennt vermutlich auch Bardford und/oder Lowry. Bei Bradford liegt die Farbveränderung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blau als Folge der Bindung an Proteine zugrunde. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffs ändert sich dabei von 465 nm (protonierte braunrote kationische Form) zu 595 nm (unprotonierte blaue anionische Form). Nur die anionische blaue Form des Farbstoffs bindet an das Protein. Die Farbe der Messlösung schlägt in Anwesenheit von Protein von einem bräunlichen Blau in ein kräftiges Dunkelblau um. Insbesondere bindet der Farbstoff an Arginyl- und Lysyl-Reste. Da aber beim pH des Assays eine bestimmte Menge einer dritten Form des Farbstoffs mit grüner Farbe (lmax = 650 nm) vorliegt, die mit der Absorption des Farbstoff-Protein-Komplexes bei 620 nm interferiert, ergibt eine Messung bei 595 nm das beste Resultat (Bradford, 1976).

Die Proteinbestimmung nach Bradford ist viel weniger störanfällig durch Chemikalien als die Bestimmung nach Lowry, da hier die Messgröße von einer direkten Interaktion des Farbstoffes mit dem Peptid anhängig ist.  Der gebildete Farbkomplex ist allerdings leicht durch Licht beeinflussbar und in seiner Intensität abhängig von der Inkubationszeit. Mercaptoethanol oder Tris können störend wirken. Glasküvetten sind für diesen Farbstoff nicht geeignet, denn man bekommt sie nach der Messung nicht mehr sauber. Plastik-Einweg-Küvetten oder Mikrotiterplatten sind die bessere Wahl und bei Absoption im blauen Farbspektrum auch kein Problem. Da dieser Farbstoff an Protein bindet, erzeugt er überall sehr resistente Flecken.

Da der Bradford-Bestimmung eine Gleichgewichtsreaktion zwischen der kationischen und der anionischen Form des Farbstoffs zugrunde liegt, besteht ein gekrümmter Zusammenhang zwischen RSA Konzentration und Extinktion (Polynom zweiter Ordnung). Das heißt die Kalibration  ist nicht gerade!! (Im Bild ein Beispiel mit Rinderserumalbumin – RSA)

Bradford, M.M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.

Proteinbestimmung nach Lowry

Noch so ein angestaubter Klassiker aus der Biochemiewelt: Lowry. Es hilft, wenn man das Prinzip verstanden hat bevor man mit der Messung beginnt, denn bei dieser Methode zur Proteinbestimmung werden die aromatischen Aminosäuren und Cystein in der Probe bestimmt. Das Ergebnis ist daher abhängig von der Aminosäurezusammensetzung des Standards und der Probe.

Sechswertiges Molybdän (eingesetzt als Heteropolyphosphorsäure) wird durch die Tyrosin-, Tryptophan, Cystein- und Histidinreste in Proteinen zu einem kolloidal gelösten Mischoxid (MoO₂+MoO₃) von blauer Farbe reduziert (Molybdänblau-Reaktion). Cu²⁺-Ionen verstärken die Empfindlichkeit des Nachweises. Das Folin-Reagenz enthält unter anderem Natriumwolframat (Na₂Wo₄) und Natriummolybdat (Na₂Mo₄).

Die Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951) wird durch Tris, Ammoniumsulfat, EDTA, Saccharose, Citrat, CAPS, CsCl, Cystein, Diethanolamin, Dithiothreitol, HEPES, Mercaptoethanol, Polivinylpyrolidon, Natriumsalicylat, Thimerosol. Tricine, Triton X-100 und Phenole gestört. (Aha! Das sind ein paar Kandidaten mit Thiol-Gruppen und aromatischen Strukturen dabei. Als hätten wir’s geahnt, dass die stören würden ;-) Liegen solche Substanzen in der Probe vor, müssen die Proteine mit Trichloressigsäure ausgefällt und anschließend in einem wässrigen Lösungsmittel, das diese störenden Substanzen nicht enthält, gelöst werden.

Leider ist bei Lowry die Extinktion von der Aminosäurezusammensetzung des Proteins abhängig – also dem Anteil der jeweils nachgewiesenen Aminosäurereste am Gesamtprotein. Einzelne Aminosäuren werden genauso angezeigt wie proteingebundene; Hauptsache sie sind aromatisch oder haben eine SH-Gruppe. Dieses Problem muss auch bei der Auswahl eines geeigneten Standards berücksichtigt werden. In der Regel wird Rinderserumalbumin als Standard verwendet, aber die Aminosäurenzusammensätzung in der Probe kann davon deutlich abweichen. Das mit Lowry auch freie Aminosäuren gefunden werden muss kein Nachteil sein, führt aber u.U. zu abweichenden Resultaten  im Vergleich zu Methoden die auf dasProtein selbst reagieren, so wie Bradford.

Außerden sollte man wissen, dass man bei Lowry mit einer Stoppuhr arbeiten muss, um die genauen Zeitabstände einzuhalten. Das kann bei mehr als 10 Proben schon zu einer Herausforderung werden. Außerdem bleibt die Farbe nur eine Stunde lang stabil. Versierte Kräfte schaffen ca. 20 Proben und 5-8 Standards in einem Durchgang.

Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. and Randall R.J. 1951. Protein measurement with a Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275.

Diese Literaturstelle ist die meistzitierte  Arbeit aller Zeiten. Da haben die Autoren gute Arbeit geleistet und freuen sich vermutlich über einen astronomischen Hirsch-Index.

Liste der 100 meistzitierten Arbeiten

Quality assurance for PAH metabolites finished

The determination of PAH metabolites in fish bile as a means of assessing ongoing and recent PAH exposure in fish is a well known method in marine monitoring (e.g. mentioned in pre-CEMP). A growing number of labs in different countries are using this parameter but an international intercalibration has not taken place during the last 10 years. Successful intercalibration is a prerequisite for recommending this method for marine monitoring. The BONUS+ project BEAST has taken the lead to perform an intercalibration exercise for PAH metabolites in fish bile. Several partners in  BEAST have expertise in the analytical procedure and use this parameter for their national monitoring programms or will do so in future. The aim of the intercalibration was to:

• enhance the comparability of PAH metabolite results produced by different labs within the project BEAST and to
• strengthen the parameter PAH metabolites for European marine monitoring by providing an intercalibration exercise for interested labs.

The intercalibration took place in 2010 and 11 laboratories from 9 countries (North Sea and the Baltic Sea) have participated.

The intercalibration exercise was terminated in January 2011 and a final report was sent to all participants. Information on the outcome of the intercalibration can be requested by ulrike.kammann@vti.bund.de.

SETAC GLB lobt Forschungspreise aus

NACHWUCHSFÖRDERUNG wird groß geschrieben beim deutschsprachigen Zweig der SETAC Europe. Daher gibt es auch in diesem Jahr wieder zwei Förderpreise für Abschlussarbeiten. Ausgezeichnet werden sollen
die beste Diplom-, Magister- oder Masterarbeit mit 1000 € und die beste Dissertation mit 3000 €.
Erwartet werden hervorragende wissenschaftliche Arbeiten aus den Themengebieten der SETAC (Umweltchemie und Ökotoxikologie), die im Jahr 2010 abgeschlossen wurden.

Die Abgabefrist endet am 28. Februar 2011.

Weitere Infos gibts im Ausschreibungtext: SETAC GLB FOERDERPREIS 2011 oder bald auch auf der der Internet-Seite: http://www.setac-glb.de

Wann ist ein interner Standard besser als ein externer?

Das ist eine typische Frage aus dem Bereich der Chromatographie. Der externe Standard ist ein robuster VW-Käfer, der für die meisten Anwendungen ausreicht. Der interne Standard ist schon ein schicker Sportwagen wie ein Opel GT mit dem man schnell und elegant zum Ziel kommt. Wer Isotopenstandards verwendet fährt quasi einen Formel 1 Rennwagen. Aber zum Brötchenholen reicht der Käfer allemal.

Ein externer Standard ist eine Lösung mit definierter Konzentration meines Analyten. Ich messe dasselbe Volumen meiner Probenlösung und meiner Standardlösung, bekomme zwei Werte und rechne den Wert aus der Probenlösung über den Dreisatz in Konzentration um. Schön einfach und unkomliziert.

Ein interner Standard ist eine Substanz die nicht mein Analyt ist und die ich meiner Probenlösung spätestens vor der Messung zugesetzt habe. Typischerweise wird der interne Standard vor der Aufarbeitung der Probe zugegeben und kann so auch noch Verluste bei der Probenvorbereitung abpuffern. Beide Substanzen dürfen sich im Messverfahren nicht überlagern und müssen in derselben Messung bestimmbar sein – am besten mit ähnlicher Empfindlichkeit. Zum Beispiel zwei Peaks von chemisch verwandten Substanzen in einem Chromatogramm. Als zweite Lösung habe ich eine Standardlösung die meinen Analyten und den internen Standard in bekannten Konzentrationen enthält. Den passenden internen Standard mus man erst mal haben und die Rechnerei ist auch komplizierter als bei einem externen Standard.

Beim Internen Standard sind die absoluten Peakflächen wurscht. Es wird nur mit Verhältnissen gerechnet. Das ist immer dann von Vorteil, wenn das Volumen der Probe vor der Injektion klein oder ungenau zu messen ist. Oft ist das bei der Rückstandsanalytik mit Gaschromatographie der Fall: Die Injektionslösung wird unterm Sticksoffstrom auf z.B. 0,2ml eingedampft. Das Volumen ist dann ist kaum genau zu messen und das flüchtige Lösungsmittel tut ein Übriges. In so einer Situation MUSS man interne Standards nehmen. Wer bequem aus einem 5 ml Volumen injizieren kann, das vielleicht in einem Messkolben aufgefüllt wurde, der braucht keinen Sportwagen sondern kann mit dem Käfer weiterzuckeln. Die Messwerte wüden durch interne Standards nicht (viel) besser werden.

Ein interner Standard MUSS auch verwendet werden, wenn man mit signifikanten Verlusten bei der Probenaufbereitung rechnet, oder während der Aufarbeitung nicht quantitativ arbeiten kann. Hier ist es zusätzlich wichtig, dass der interne Standard die gleiche Chance hat bei der Probenaufarbeitung zu verschwinden wie der Analyt, weil er sich chemisch und physikalisch ähnlich verhält. Wenn beide Substanzen in der Aufarbeitung zu 80% verlustig gehen und dieses Verhältnis konstant bleibt, ist alles gut und man kann messen.

Praktisches Vorgehen für Messung mit internen Standards und Kalibrierfunktion:

1. Standardlösungen mit dem Analyten in verschiedenen Konzentrationen in Messkolben ansetzen
2. Internen Standard zu allen Standardlösungen in der selben Konzentration zugeben – erst jetzt Kolben auffüllen.
3. Standardlösungen messen und Kalibration erstellen (Verhältnis der Peaks gegen Verhältnis der Konzentration von internem Standard und Analyt)
4. Internen Standard zur Probe geben
5. Probe messen und Konzentration des Analyten über Peakverhältnis aus der Kalibration berechnen.

Üblich ist HPLC mit externen Standard und GC mit internen Standards zu betreiben, da das Problem der kleinen Volumina beim GC regelmäßig auftritt.

Interne Isotopenstandards werden erst beim GC-MS sinnvoll, aber selbst hier reichen ab und zu die normalen internen Standards aus.

Nachweisgrenze abhängig vom Injektionsvolumen

Die Nachweisgrenze bei GC ode HPLC ist abhängig von mindestens drei Dingen:

1. Sensitivität der Methode
2. Eingesetzte Probenmenge bzw. Verdünnungsfaktor
3. Injektionsvolumen

Nehmen wir an, ich habe meine Nachweisgrenze (NWG) berechnet oder abgeschätzt. Ich weiss, dass ich 1 ng/µl detektieren kann. Vielleicht ist mein kleinster Standard 0,5 ng/µl konzentriert und macht noch einen schönen Peak, der symmetrisch und höher als breit ist. Dann wären berechnete 1 ng/µl plausibel. Die NWG der Methode möchte ich nun in ng/mg Probe umrechnen.

Das ist wieder so ein Fall, wo man denkt, das müsste doch ganz einfach sein. Tja, aber die Tücke steckt im Detail:

Wenn ich im einfachen Fall 1 g Probe extrahiert habe und den Extrakt quantitativ in 1ml GC-(HPLC-)fertigen Extrakt überführt habe, dann ist es schon mal gut und ergibt eine NWG von 1 ng/g Probe Jetzt muss ich nur noch die selbe(!) Menge Probenlösung und Standardlösung in mein Messgerät injizieren und die Konzentrationsangaben auf den Standards entsprechen 1:1 der in meiner Probenlösung.

Nehmen wir an ich injiziere für Probe und Standard 1 µl und habe als Ergebnis 2 ng/µl gefunden – prima! Meine absolute NWG läge dann bei 1 ng/µl  (1 ng/g Probe), mein Ergebnis mit 2 ng/µl ist höher und ich kann die Zahl in meine Tabelle eintragen.

Nun kann es in der Praxis vorkommen, dass in einer Probe mal niedrigere Konzentrationen hat und ich daher einfach mehr- zum Beispiel 2 µl- in mein Messgerät injiziere. (Nehmen wir weiter an das Rauschen oder die Probenmatrix spielen keine Rolle.) Der Peak wird größer, ich kann wieder messen und teile als aufmerksame Analytikerin mein Messergebenis durch 2 und erhalte z.B. 1 ng/µl (1 ng/g Probe). Hmmm … liegt ja genau auf meiner NWG – oder doch nicht? Was man schnell übersieht ist, dass sich jetzt auch die Nachweisgrenze verändert hat. Bei Injektion von 2 µl Probe und weiterhin 1 µl Standard sinkt meine Nachweisgrenze auf 0,5 ng/ml  (0,5 ng/g Probe). Eine halb so große Konzentration in der Probe erzeugt bei doppeltem Injektionsvolumen den Peak, den ich grad noch nachweisen kann. Ich habe also meine ganze Methode mit allen Qualitätsparametern verändert, wenn ich mein Injektionsvolumen oder meine Einwaage oder die Verdünnung während der Aufarbeitung ändere.