Archiv der Kategorie: Molekularbiologie

Gene raten?

Forschungsthemen haben immer etwas mit Mode zu tun. Technische Neuerungen sind eine wichtige Kraft, um neue Themenfelder zu entwickeln und wachsen zu lassen. In den letzten 10 Jahren haben die “Omics” einen großen Sprung nach vorn gemacht. RT-PCR und DNA-Chips machen es möglich. Mittlerweile haben wir uns von Genomics über Proteomics bis zu den Metabolomics vorgearbeitet (geht es noch weiter?). Trotzdem bin ich persönlich bei vielen Studien noch skeptisch. Ich glaube nicht an die Stratgie eine Chemikalie in einem Testsystem quasi nach dem Gießkannenprinzip zu testen: 250 Gene (bzw. Proteine oder Enzyme) sind nach der Exposition mit Chemikalie X hoch reguliert, 100 Gene runter reguliert und nach ein paar RT-PCR-Untersuchungen zu Absicherung kann man darüber philosophieren warum der Citratzyklus oder der Fettsäurestoffwechsel in meinem Testorganismus beeinflusst wurde.

Wie es anders geht? Ganz einfach – Man braucht eine Hypothese, eine Idee, eine Theorie wie die Chemikalie wirkt und guckt sich dann gezielt die Gene an, die mit dem Stoffwechselweg zusammenhängen. Am besten funktioniert das, wenn man beispielsweise beim Zebrafischembryo eine Chemikalien-iduzierte morphologische Veränderung (an Augen, Herz, Wirbelsäule…) entdeckt hat, und diese dann mit den Genen in Beziehung setzen kann. Beim Zebrafisch ist dieser Weg besonders dankbar, weil das Genom aufgeklärt ist und zahlreiche Publikationen vorliegen.

Man braucht also nicht unbedingt die Gießkannenmethode per DNA-Chip.
Man rät einfach die Gene, weil man eine Hypothese hat.

RNA-Isolierung aus Zebrafisch Embryonen oder Larven

RNA-ExtraktionDie Isolierung von RNA ist nicht trivial – schon gar nicht aus Fischeiern. Wenn man einige Randbedingungen beachtet ist es aber einfacher als man denkt. Der größte Feind der RNA sind RNAsen, die praktisch überall - besonders an den Fingern des Analysators – zu finden sind. Also: Embryonen in flüssigen Stickstoff schockgefrieren, schnell und in RNAse-Inhibitor Puffer wieder auftauen. Handschuhe, Kittel und ein sauberer Arbeitsplatz sind Pflicht. Bitte auch die Plastikteile nur mit sauberen Handschuhen oder Pinzetten anfassen. Pipettenspitzen mit Handschuhen in die Boxen stecken oder fertig gesteckte verwenden. Frisch gekaufte Plastikwaren sind in der Regel RNAse frei. Die Probe sollte während der Extraktion immer auf Eis gekühlt werden, obwohl RNA höhere Temperaturen verträgt. Potentiell enthaltene Enzyme kommen in der Kälte aber nicht zum Zug.

  1. Vor der RNA-Extraktion muss homogenisiert werden. Für Gewebe wie Embryonen oder Larven eignet sich ein Pistell im (blauen) Reaktionsgefäß. Diese Pistelle sind Einwegartikel, die man im Laborfachhandel kauft. Motorgetriebene Varianten sind auch schön.
    Alle nötigen Puffer sind im Extraktions-Kit der Säulen enthalten und gewährleisten stark denaturierende Bedingungen  mit Guanidinium Isothiocyanat und ß-Mercaptoethanol.
  2. Nach dem Mörsern wird die Probe mehrfach mit einer 1 ml Einweg-Spritze aufgezogen. Auch das dient der Homogenisierung.
  3. Extrahieren kann man das Homogenat auf verschiedene Weise. Am einfachsten und am teuersten ist die Verwendung von Extraktionskits mit Säulen für die Zentrifuge (spin-columns). Hier werden die selektiven Bindungseigenschaften einer Silica-Membran mit Zentrifugations- und Waschschritten kombiniert. Die RNA (> 200 Nukleotidetide) wird in Gegenwart eines Puffersystems mit einer hohen Konzentrationen an chaotropen Salzen an die Silica-Gel Membran gebunden und nach mehreren Waschschritten mit ca. 30 μl nukleasefreiem  Wasser eluiert.
    Die abgebildete Variante eignet sich gut für 10 – 100 Eier / Larven.
  4. Aus 10 Larven kann man so etwa 5 µg RNA in nur wenigen Arbeitsstunden extrahieren. Diese Menge ist für die meisten PCR-Anwendungen ausreichend auch wenn der Anteil mRNA (messenger RNA) nur 2% der isolierten Gesamt RNA ausmacht.

Ethidiumbromid im Biochemie-Labor

Die jahrelange Verwendung von rotem, giftigen Ethidiumbromid kann man ganz einfach dadurch sichtbar machen, dass man die Fluoreszenz-Lampe in der Deckenbeleuchtung zuschaltet. Das Resultat sähe dann so ähnlich aus wie auf diesem Foto.

Das Bild stammt natürlich NICHT aus einem Labor sondern gehört in eine Hamburger Kunstausstellung.
Trotzdem könnte die Wirklichkeit nicht weit von der Situation im Bild entfernt sein. Natürlich haben wir alle keine Kaffeemaschine im Labor stehen ;-)

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Zellen die Dioxine anzeigen

Wie analysiert man toxisch wirkende Substanzen? Der klassische Weg ist die chemische Analytik, mit deren Hilfe Einzelsubstanzen quantifiziert werden. Das sind aber meist nur diejenigen, die man von vornherein in der Probe vermutet hat. Mit chemischen Screening Verfahren kann nach „neuen“ Substanzen gefahndet werden, die bisher nicht im Blickfeld des Analytikers lagen. Aber auch beim sogenannten „non-target-sreening“ ist das Stoffspektrum durch apparative Randbedingungen begrenzt; die Methoden sind aufwändig, teuer und ungeeignet für den Routinebetrieb. Die Gefahr die entscheidenden Substanzen zu übersehen ist also immer gegeben.

Unter der Cleanbench

Einen Ausweg aus diesem Problem bietet die biologische Detektion. Spezifische Zellsysteme zeigen die integrierte Antwort aller enthaltenen wirksamen Substanzen, auch der unbekannten, an. Für den chemischen Analytiker sind die Zellsysteme besonders interessant, die spezifische Reaktionen und/oder bestimmte Stoffgruppen anzeigen. Hierbei handelt es sich um genetisch veränderte Zellen, in deren Erbinformation ein spezifischer Rezeptor etwa in Verbindung mit dem Luciferase-Gen eingebaut wurde. Die als krebserreggend eingestuften Dioxine (polychlorierte Dibenzo-p-dioxine und Dibenzofurane) und einige PCBs (polychlorierte Biphenyle) haben im wesentlichen den selben Wirkmechanismus. Basierend auf dieser Erkenntnis wurden Leberzellen gentechnisch modifiziert und für die Detektion von Dioxin-Wirkungen „maßgeschneidert. Diese Zellen haben die beeindrucken Eigenschaft in Anwesenheit von Dioxinen und Co zu leuchten. Das Gen, das die Substanzen erkennt (Rezeptor) und damit “angeschaltet” wird ist mit einem Gen für Luminiszenz (Prinzip Glühwürmchen) gekoppelt. Je mehr Dioxine in der Umgebung der Zelle sind, desto heller leuchtet sie. In anderen Zelllinien wird nicht das “Anschalten” eines Genes sondern das produzierte Protein (EROD) messtechnisch erfasst.

EROD-produzierende  Zellsysteme gibt es auch vom Fisch. Sie wurden bereits erfolgreich zur Untersuchung von Umweltkontamination eingesetzt. Guckst du hier.

Frühling in der PCR-Schublade

Der Frühling hat Einzug gehalten in die Stadt. Die Kleider werden luftiger und die Röcke werden kürzer. Wen wundert es da, dass diese Entwicklung auch vor dem Labor nicht halt macht. Nein – ich meine keinen sommerlich kurzen Laborkittel sondern die leicht geschürzten PCR-Platten. Es gibt sie mit langem Rock (“skirted”), mit kurzem Rock (“semi-skirted”) und ganz ohne Rock (“unskirted”). Der “skirt”, also der Rand drumherum, verleiht den Platten etwas mehr Standfestigkeit.

Der wahre Grund für die Ansammlung verschiedener Rocklängen im Labor ist  die Vorliebe jedes PCR-Geräts für seine spezielle Plattenart. Jeder Hersteller will nicht nur sein Gerät, sondern später auch jahrelang seine Platten verkaufen. Also passt nichts zusammen und die Schubladen werden immer voller.

Links: halber Rock; rechts: ohne RockWenn man sich schon auf das 96-Well-Design einigen konnte, warum nicht dann auch auf die anderen Dimensionen und die Rocklänge? Ich warte gespannt  :-)

PCR Hymne

Dieses gefühlvolle  youtube-Video ist ein Sahnestück für jeden PCR-Anhänger!

Mein Forschungsobjekt: Der Zebrafisch

Der Zebrabärbling (englisch: zebrafish, neudeutsch: Zebrafisch, lateinisch: Danio rerio) ist das Lieblingstier der Entwicklungsbiologen und Genetiker. Früher waren es die Fruchtfliege, doch heute forscht sogar die Nobelpreisträgerin Christiane Nüsslein-Volhard am Zebrafisch. Das Genom dieses kleinen Aquarienfisches ist komplett aufgeklärt und eröffnet damit eine uk-blog-031-fullSpielwiese für Genetiker. Die Embryonalentwicklung der Tiere ist in wenigen Tagen abgeschlossen und man kann durch die transparente Eihülle quasi dabei zugucken. Neu herausgefischte Gene werden vom Entdecker mit einem wohlklingenden Namen bedacht. So gibt es etwa die Gene “pekinese (kurzer Kopf)”, “faust” (zwei herzen) und “roling stones” (lose Gehörsteine). Toll sind auch die genetisch veränderten Zebrafische, in deren Code man beispielsweise Gene für ein rotes Protein eingeschleust hat. Diese Fische sind tatsächlich komplett rot und fangen theoretisch an zu leuchten, wenn das Gen, das man unsichtbar an das rote gekoppelt hat, angesprochen wird. Leider hat sich das Konzept der leuchtenden Fische nicht durchgesetzt. Vielleicht leichten sie doch nicht so hell ;-)

Der Fischeitest mit den Eiern des Zebrafischs kann akut toxische Wirkungen von Schadstoffen durch morphologische Veränderungen am Embryo zeigen. Nach 48 Stunden Embryonalentwicklung ist der Test abgeschlossen und man braucht nach deutschem Recht (noch) keinen Tierversuchsantrag zu stellen. Mit den selben Embryonen kann man Genexpresionsstudien machen und so die Wirkung von Schadstoffen auf den Organismus sehr gezielt untersuchen.